3.4 Techniques moléculaires


Les tests moléculaires (ou génotypiques) peuvent être utilisés pour diagnostiquer la TB grâce à l'amplification des acides nucléiques (ADN ou ARN). Ils sont également utilisés pour détecter une pharmacorésistance en identifiant une mutation génétique (allèles associés à une résistance aux médicaments) de la bactérie responsable (antibiogramme génotypique). Différents tests et plates-formes ont été développés.

3.4.1 PCR en temps réel (test Xpert MTB/RIF)

Ce test permet de diagnostiquer une TB et une résistance à la rifampicine. Contrairement à d'autres techniques (culture in vitro, antibiogramme et techniques moléculaires classiques), le test Xpert MTB/RIF peut être utilisé dans des laboratoires périphériques et sa réalisation n’exige pas de matériel sophistiqué ni de personnel hautement qualifié10,11,12,13.

Le test est basé sur la PCR en temps réel. Il cible les séquences d'acides nucléiques spécifiques dans le génome du complexe M. tuberculosis et fournit simultanément des informations sur les mutations les plus fréquentes liées à résistance à la rifampicine.

Il s'agit d'un test automatisé (3 étapes manuelles seulement), géré dans un système fermé avec une cartouche par échantillon, donc moins susceptible d’être contaminé que d'autres tests basés sur la PCR. Chaque instrument peut traiter simultanément 4 échantillons, en moins de 2 heures. Il existe des instruments de plus grande capacité. Pour plus d'informations, se référer à l'Annexe 3.

Les performances de ce test sont proches de celles de la culture. Les études ont montré que pour la détection de la TBP, la sensibilité est de 98% pour les échantillons frottis positif, culture positive et 72% pour les échantillons frottis négatif, culture positive (la sensibilité peut atteindre 90% si le test est répété 3 fois)14,15.

Le test Xpert MTB/RIF a également une bonne sensibilité (environ 80%) et une excellente spécificité (> 98%) lorsqu’il est effectué sur des échantillons de liquide céphalo-rachidien, suc ganglionnaire et liquide gastrique16.

Du fait de ses bonnes performances, de sa rapidité et de sa simplicité d’utilisation, ce test doit être utilisé en première intention chez les patients infectés par le VIH et lorsqu’une TB multirésistante (TB-MR) ou une TB méningée sont suspectées, aussi bien chez l’adulte que chez l’enfant.

Il peut également être utilisé pour le diagnostic de la TB ganglionnaire. Son utilisation sur le liquide pleural n’est pas recommandée du fait de sa faible sensibilité.

La sensibilité du test à détecter la résistance à la rifampicine (RIF) comparée à celle de l’antibiogramme conventionnel sur culture est de 97,6%. La valeur prédictive négative du test étant élevée, les souches non résistantes à la rifampicine peuvent être considérées comme des vraies souches sensibles.

Dans les populations où la prévalence de la TB-MR est inférieure à 10%, la valeur prédictive positive est inférieure à 85% (Annexe 3). En conséquence, un test Xpert avec un résultat RIF positif doit être immédiatement répété afin d’éliminer de possibles erreurs d’étiquetage ou de transcription. Si le second test ne montre pas de résistance à la rifampicine, le patient est considéré comme présentant une TB sensible. Si le second test montre également une résistance à la rifampicine, celle-ci doit être confirmée par un antibiogramme phénotypique ou une méthode génotypique différente.

Le test MTB/RIF ne remplace pas les microscopies, cultures et antibiogrammes conventionnels, qui restent nécessaires pour suivre l’évolution du traitement et détecter les résistances à d’autres médicaments que la rifampicine.

3.4.2 Line probe assay (LPA)

Il n’existe pas actuellement de test LPA entièrement automatisé. Ces tests moléculaires ne peuvent être pratiqués que dans des laboratoires spécialisés avec strictes procédures d’assurance de qualité.

Il existe plusieurs tests moléculaires :
– L’amplification conventionnelle de l’acide nucléique (Nucleic Acid Amplification, NAA) de M. tuberculosis suivie d’une LPA permet la détection de certaines séquences génétiques du bacille à l’aide d’une sonde (probe). Les tests NAA actuellement disponibles ont une sensibilité inférieure à celle de la culture et ne sont pas recommandés pour le diagnostic le la TB. Ils sont également trop complexes pour être employés en routine dans la plupart des laboratoires.
– Deux techniques moléculaires sont disponibles sur le marché :
• Les tests Hain: GenoType®MTBDRplus et GenoType®MTBDRsl (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Allemagne). Le test GenoType®MTBDRplus présente de bonnes performances pour la détection des résistances à la rifampicine et dans une moindre mesure à l’isoniazide chez les patients à frottis positif (dans une étude multicentrique, sa sensibilité et sa spécificité pour la rifampicine et l’isoniazide était de 95,3 et 95,5% et de 89,9 et 87,1%, respectivement)17,18. Le test GenoType®MTBDRsl permet la détection de la résistance aux fluoroquinolones et aux injectables avec une bonne spécificité mais une moindre sensibilité (85% pour les fluoroquinolones et 43 à 84% pour les injectables)19.
• Le test INNO-LiPA Rif. TB® (Innogenetics, Belgique)20.

Le test GenoType®MTBDRplus permet d'identifier des mutations sur les gènes katG ou inhA:
– Mutation sur le gène katG correspondant à la résistance à l'isoniazide à forte dose ;
– Mutation sur le gène inhA correspondant à la résistance à l'isoniazide et l’éthionamide, mais peut-être pas à l'isoniazide à forte dose.

Le test GenoType®MTBDRsl peut être utilisé comme test de triage pour les patients à microscopie positive présumés atteints de TB ultra-résistante (TB-UR) afin de guider le traitement initial en l’attente d’une confirmation par test phénotypique. Cependant les tests LPA ne peuvent remplacer les tests phénotypiques conventionnels pour le diagnostic des résistances aux antituberculeux de deuxième ligne.

Ces méthodes moléculaires ont l’avantage de fournir des résultats rapides, en quelques heures, pour les patients à frottis positif (appelées « tests directs » car elles sont réalisées directement sur le crachat). Pour les patients à frottis négatif, une culture primaire est nécessaire avant de réaliser le test (appelé « test indirect » car une culture doit au préalable être réalisée à partir du crachat).

Afin de bénéficier de la rapidité de ces tests, il est indispensable d’avoir un support logistique approprié pour le transport du crachat vers le laboratoire de référence et le retour rapide des résultats. Les principales contraintes de ces tests sont leur coût élevé, le haut niveau de technicité requis pour le personnel, les infrastructures nécessaires et le risque important de contamination croisée.