Annexe 2. Préparation des frottis de crachats

2.1 Coloration de Ziehl-Neelsen à chaud

Matériel

– Gants et masque de protection
– Eau distillée ou filtrée
– Fuchsine basique phéniquée
– Alcool-acide à 3% (éthanol + acide chlorhydrique)
– Bleu de méthylène à 0,3%

Technique

– Recouvrir complètement la lame de fuchsine (après avoir filtrer la fuchsine).
– Chauffer doucement la lame. Dès l’apparition des premières vapeurs, compter 5 minutes en maintenant l’émission de vapeurs sans faire bouillir ni assécher la lame.
– Rincer délicatement la lame à l’eau distillée ou filtrée jusqu’à ce que le liquide de rinçage soit incolore, égoutter.
– Recouvrir la lame avec une solution alcool-acide à 3%, laisser agir 3 minutes et égoutter. Répéter l’opération 2 à 3 fois, jusqu’à ce que la lame soit complètement décolorée.
– Rincer la lame à l’eau distillée ou filtrée, égoutter.
– Recouvrir la lame de bleu de méthylène à 0,3% et laisser agir 1 minute.
– Rincer délicatement la lame à l’eau distillée ou filtrée jusqu’à ce que le liquide de rinçage soit incolore et laisser sécher à l’air.

Lecture

Une lame doit être examinée pendant 15 minutes en moyenne (au moins 300 champs), par un technicien expérimenté, avant de rendre un résultat négatif. Un technicien peut difficilement lire plus de 20-25 lames par jour sans que la qualité en pâtisse.
Les bacilles tuberculeux sont colorés en rouge vif sur fond bleu, droits ou légèrement incurvés, disposés par groupe de 3 à 10.

Enregistrement des résultats

Il existe deux échelles de quantification : celle de l’Organisation mondiale de la Santé et de l’Union Internationale contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires (WHO-IUATLD) et celle de l’US Centre of Disease Control et de l’American Thoracic Society (CDC-ATS). Chaque champ est un champ au fort grossissement (CFG).

Echelle de quantification WHO-IUATLD

Nombre de BAAR*

Notation du résultat

Pas de BAAR

0

1−9 BAAR pour 100 champs

Rares (noter le nombre de BAAR)

10−99 BAAR pour 100 champs

1+

1–10 BAAR par champ

2+

Plus de 10 BAAR par champ

3+

* bacille acido-alcoolo résistant

Noter que 1-9 BAAR pour 100 CFG est rapporté comme “rares” et le nombre exact de BAAR doit être mentionné. Par exemple, “rares 3” signifie qu’il y a 3 BAAR pour 100 CFG, à ne pas confondre avec “BAAR 3+”. Les résultats “rares” sont considérés comme des résultats positifs.

Echelle de quantification CDC-ATS

Nombre de BAAR

Notation du résultat

0

Négatif

1−2 BAAR pour 300 champs

+/-

1–9 BAAR pour 100 champs

+

1–9 BAAR pour 10 champs

++

1–9 BAAR pour 1 champ

+++

Plus de 9 BAAR pour 1 champ

++++

2.2 Coloration à l’auramine O

Matériel

– Gants et masque de protection
– Eau distillée ou filtrée
– Solution d’auramine O à 1%
– Alcool-acide à 0,5%
– Solution de permanganate de potassium à 0,5%
– Microscope à fluorescence (ou dispositif LED à adapter sur un microscope standard)

Technique

– Couvrir la lame d’auramine O à 0,1% ; la laisser colorer pendant 15 minutes en s’assurant qu’elle reste recouverte de solution.
– Rincer la lame à l’eau distillée ou filtrée jusqu’à ce que l’eau de rinçage soit claire et égoutter. Ne pas utiliser d’eau chlorée pour éviter de perturber la lecture de fluorescence.
– Couvrir la préparation d’alcool-acide à 0,5% pendant 2 minutes pour la décolorer.
– Rincer la lame à l’eau distillée ou filtrée et égoutter.
– Couvrir la préparation de permanganate de potassium à 0,5% ; la laisser colorer 2 minutes. Il est essentiel de respecter le temps de coloration, un dépassement du temps de coloration peut diminuer la fluorescence des BAAR.
– Rincer à l’eau distillée ou filtrée et égoutter. Essuyer le dos de la lame avec une serviette en papier propre.
– Laisser sécher la lame à l’air. Lire le plus rapidement possible après coloration.

Remarque : pour contrôler la qualité de la coloration, il faut inclure au moins un frottis connu comme étant positif dans le lot.

Lecture

– Toujours lire la lame du contrôle positif en premier. Si le contrôle positif n’est pas positif (pas de fluorescence), ne pas lire les frottis des patients, recolorer le lot.
– Examiner l’aspect du frottis : fond noir sans débris ni artefacts.
– Lire une longueur du frottis (environ 40 champs).

Enregistrement des résultats

Nombre de BAAR

Notation du résultat

0 BAAR pour 1 longueur

Négatif

1−19 BAAR pour 1 longueur

Rares (noter le nombre de BAAR)

20–199 BAAR pour 1 longueur

1+

5–50 BAAR pour 1 champ

2+

Plus de 50 BAAR pour 1 champ

3+

Remarques :
– Les lames doivent être lues par un laborantin entraîné (les artéfacts sont fréquents).
– La fluorescence reste stable pendant seulement 3 jours, quand la lame est protégée de la lumière. Le contrôle qualité doit être organisé en conséquence.

2.3 Sédimentation à l’eau de Javel

Matériel

– Gants et masque de protection
– Tube de 15 ml en plastique conique, avec bouchon à vis
– Eau de Javel à 3,5% (12° chl)1
– Vortex (facultatif)
– Pipettes
– Lames

Technique

– Placer le crachat dans le tube de 15 ml.
– Ajouter une quantité égale d’eau de Javel à 3,5%.
– Fermer hermétiquement le tube, agiter énergiquement jusqu’à ce que le mélange soit homogène.
– Laisser sédimenter à température ambiante pendant 15 à 18 heures.
– A l’aide d’une pipette, transférer avec précaution le surnageant dans une poubelle contenant une solution de chlore à 1%.
– Mélanger le culot avec le liquide restant.
– Placer 2 gouttes de sédiment sur une lame.
– Réaliser l’étalement et laisser sécher à l’air, en position horizontale.
– Lorsque l’étalement est complètement sec, le fixer en passant la lame 3 fois sur une flamme.



Footnotes
Ref Notes
1

Vérifier la concentration réelle en chlore actif dans l’eau de Javel avec un pool testeur.