Annexe 4. Examen microscopique des crachats

Mise à jour : Janvier 2022

4.1 Préparation des frottis de crachats

Le personnel présent lors de la préparation de frottis de crachats doit porter un masque de protection respiratoire (FFP2 ou N95) pour éviter l’inhalation de bacilles.

Les frottis de crachats doivent être préparés rapidement après le prélèvement.

Matériel

• Gants
• Lames de verre neuves et propres (ne jamais réutiliser les lames)
• Applicateurs en bois 

Technique

• Étiqueter la lame à une extrémité, avec la date du recueil des crachats et le numéro de série du laboratoire.
• Sélectionner une portion de l'échantillon de crachat contenant des particules muco-purulentes ou du sang.
• Utiliser un applicateur pour la transférer sur la lame.
• Étaler l'échantillon sur une surface de 1,5 à 2 cm x 2 à 3 cm. Il doit être suffisamment fin pour pouvoir voir à travers.
• Laisser le frottis sécher à l'air libre pendant 15 minutes. Ne pas le sécher à la lumière directe du soleil ou au-dessus d'une flamme.
• Fixer le frottis en passant le dessous de la lame à la flamme pendant 2 à 3 secondes. Répéter l'opération 3 ou 4 fois. 
• Laisser refroidir avant de colorer.

4.2 Coloration de Ziehl-Neelsen à chaud

Matériel

• Gants 
• Eau distillée ou filtrée
• Fuchsine basique phéniquée 0,3%
• Alcool-acide 3% 
• Bleu de méthylène 0,3%
• Microscope binoculaire avec objectif à immersion à l’huile (grossissement 100x)

Technique

• Recouvrir la lame de fuchsine 0,3% (après avoir filtrer la fuchsine).
• Chauffer doucement le dessous de la lame. Dès l’apparition de vapeurs, compter 5 minutes en maintenant l’émission de vapeurs sans faire bouillir ni sécher le colorant.
• Rincer doucement la lame jusqu’à ce que l’eau de rinçage soit incolore puis égoutter.
• Recouvrir la lame avec une solution d'alcool-acide 3%, laisser agir 2 à 3 minutes puis égoutter. Répéter l'opération si la lame n'est pas complètement décolorée.
• Rincer la lame puis égoutter.
• Recouvrir la lame de bleu de méthylène 0,3% pendant une minute puis égoutter.
• Rincer doucement la lame jusqu’à ce que l’eau de rinçage soit incolore puis égoutter.
• Laisser sécher à l’air. Ne pas essuyer ni tamponner la lame.

Lecture

• Les lames doivent être examinées par un technicien expérimenté, qui doit disposer du temps nécessaire pour lire les lames avec précision.
• Avant l'examen de la lame, appliquer une goutte d’huile à immersion sur le bord gauche du frottis coloré. Ne pas toucher la lame avec l’applicateur d’huile à immersion (risque de transfert de BAAR dans le flacon d'huile ou sur une autre lame).
• Examiner au moins une longueur (100 champs à fort grossissement, CFG), avant de déclarer un résultat négatif (l'opération doit durer au moins 5 minutes).
• Les BAAR sont des bâtonnets rouges sur fond bleu. Ils sont droits ou légèrement incurvés. Ils peuvent être isolés ou en petits groupes. 

Notation des résultats

Tableau 4.1 – Échelle de quantification (OMS-IUATLD) [1] Citation 1. European Centre for Disease Prevention and Control. Handbook on tuberculosis laboratory diagnostic methods in the European Union – Updated 2018. Stockholm: ECDC; 2018.
https://www.ecdc.europa.eu/sites/portal/files/documents/TB-handbook-updated-2018.pdf

Remarque : 1-9 BAAR dans 100 CFG est un résultat positif. Noter que 1-9 BAAR dans 100 CFG est rapporté comme « rares » bacilles, suivis du nombre exact de BAAR observés dans 100 CFG (p. ex. « rares bacilles 3 » signifie 3 BAAR dans 100 CFG).

Ne pas confondre « rares bacilles 3 » (3 BAAR dans 100 CFG) avec BAAR 3+ (plus de 10 BAAR par CFG).

4.3 Coloration à l’auramine O ou à l'auramine/rhodamine

Matériel

• Gants 
• Eau distillée ou filtrée (mais non chlorée)
• Auramine O 0,1% ou auramine/rhodamine
• Alcool-acide 0,5%
• Permanganate de potassium 0,5% ou bleu de méthylène 0,3%
• Microscope à fluorescence (ou dispositif LED adapté sur un microscope standard)

Technique

• Recouvrir la lame d’auramine ou d'auramine/rhodamine. La laisser colorer 15 minutes. S'assurer qu’elle reste recouverte de solution.
• Rincer la lame jusqu’à ce que l’eau de rinçage soit incolore puis égoutter. Ne pas utiliser d’eau chlorée pour éviter de perturber la lecture de la fluorescence.
• Recouvrir la lame d’alcool-acide 0,5% pendant une minute puis égoutter.
• Rincer la lame puis égoutter.
• Recouvrir la lame de permanganate de potassium 0,5% ou de bleu de méthylène 0,3%. La laisser colorer une minute (ne pas dépasser 2 minutes) puis égoutter. 
• Rincer puis égoutter. Essuyer le dessous de la lame avec une serviette en papier propre.
• Laisser sécher à l’air. Ne pas essuyer ni tamponner la lame.

Remarque : pour contrôler la qualité de la coloration, il faut inclure au moins un frottis connu comme étant positif dans le lot.

Lecture

• Les lames doivent être examinées par un technicien expérimenté, qui doit disposer du temps nécessaire pour lire les lames avec précision.
• Utiliser un objectif 20x pour screener le frottis.
• Examiner une longueur avant de déclarer un résultat négatif.
• Toujours lire la lame du contrôle positif en premier. Si le contrôle positif n’est pas positif (pas de fluorescence), ne pas lire les frottis des patients, recolorer le lot.
• Les BAAR sont des bâtonnets jaune vif sur fond sombre. Ils sont droits ou légèrement incurvées. Ils peuvent être isolés ou en petits groupes. Les débris non spécifiques se colorent en jaune pâle.

Notation des résultats

Tableau 4.2 – Échelle de quantification (OMS-IUATLD) [1] Citation 1. European Centre for Disease Prevention and Control. Handbook on tuberculosis laboratory diagnostic methods in the European Union – Updated 2018. Stockholm: ECDC; 2018.
https://www.ecdc.europa.eu/sites/portal/files/documents/TB-handbook-updated-2018.pdf

• 1-29 BAAR par longueur est un résultat positif. Noter que 1-29 BAAR par longueur est rapporté comme « rares » bacilles, suivis du nombre exact de BAAR observés par longueur (p. ex. « rares bacilles 3 » signifie 3 BAAR par longueur).
  Ne pas confondre « rares bacilles 3 » (3 BAAR par longueur) avec BAAR 3+ (plus de 100 BAAR par champ).
• La fluorescence reste stable pendant seulement 3 jours, quand la lame est protégée de la lumière. Le contrôle qualité doit être organisé en conséquence.