Annexe 4. Examens biologiques

La confirmation biologique est basée sur la recherche d’anticorps spécifiques du virus de la rougeole (détection des IgM par test ELISA).
Les tests fondés sur la détection du virus (technique RT-PCR nichée) ne sont pas faits pour diagnostiquer des cas mais pour étudier le génome (surveillance de la rougeole dans le monde) ou pour isoler le virus.
Quelque soit le type d’examen réalisé, les techniques de prélèvement restent les mêmes.

4.1 Prélèvements

4.1.1 Prélèvement de sang capillaire sur papier filtre

Matériel

• MODULE GOUTTES DE SANG SECHE (DBS) & TRANSPORT 2017 [KMEDMSAMDBS3] :
• CHLORHEXIDINE 2%, 70% d'alcool isopropylique, TAMPON/LINGETTE [DEXTCHLHA2W],
  1er choix
• CARTE, INDICATEUR D’HUMIDITE, 10 - 60 % [ELABHUMI2C-]
• GEL DE SILICE, granulés, avec indicateur saturation, 5 g,sach [SLASSILI1C5]
• LANCETTE DE SECURITE grand débit, lame 1,2x1,5 mm, rose, u.u. [STSSLANCSH3]
• CARTE PRELEVEMENT ECHANTILLON, 5 disques perforés (Munksjö) [STSSSACC2]
• PORTOIR séchage [STSSSACC101]
• SACHET, plast, gaz imperm, glissière [STSSSACC102]

Accessoires complémentaires
 

• HYDRO-ALCOOLIQUE, solution, 500 mL, fl. [DEXTALCO5S-]
• SUCROSE, 24% solution orale, 2 mL, fl. [SDDCSUCR2V2], pour enfants < 6 mois
• COMPRESSE, NON TISSEE, 4 plis, 7,5 cm, non stérile [SDRECOMN7N-]
• COTON hydrophile, rouleau, 500 g [SDRECOTW5R-]
• CONTAINER D'OBJETS TRANCHANTS [SINSCONT++]
• GANTS D’EXAMEN, latex, u.u. non stérile [SMSUGLOE1+++]

Procédure de prélèvement

• Réaliser une procédure d’hygiène des mains et demander au patient de réaliser une procédure d’hygiène des mains à l’eau et au savon si prélèvement au doigt.
• Mettre des gants non stériles.
• Les cartes de prélèvement pour papier filtre doivent être identifiées avec le numéro d’identification unique du patient et la date de prélèvement. Veiller à ne pas toucher les cercles.
• Choisir le site de ponction (doigt ou côtés du talon si enfant < 6 mois). Positionner la main inclinée vers le bas, paume vers le haut, et choisir le doigt à piquer (majeur ou annulaire).
• Appliquer une pression intermittente sur le doigt choisi ou sur le pied.
• Pour les nourrissons (< 6 mois), envisager l’utilisation de solution buvable de sucrose 
  2-3 minutes avant la ponction et si la procédure dure plus de 5 minutes, une 2^e dose peut être donnée. Un drap ou une serviette pourra aider à maintenir les bras de l’enfant si nécessaire.
• Désinfecter correctement le site de ponction avec la lingette de chlorhexidine avec un mouvement de va et vient, pendant 30 secondes (sauf pour la néonatalogie, utiliser de l’eau chaude et de la gaze/coton uniquement). Laisser sécher.
• Réaliser un massage autour de la zone de prélèvement avant et pendant le prélèvement (pas sur la zone de prélèvement). Il ne faut pas presser le doigt/le pied.
• Retirer la protection sur la lancette. Tenir fermement le doigt et placer la lancette sur le côté de la dernière phalange du doigt. Pour le prélèvement au talon, mettre le pied en flexion, le maintenir en position avec la main non dominante, en plaçant un doigt sur la voûte plantaire et le pouce sous le site de ponction, au niveau de la cheville.
• Presser fermement sur le dessus de la lancette pour piquer le site de ponction et éliminer la lancette.
• Essuyer la première goutte de sang avec de la gaze ou un coton sec et laisser le sang couler (idéalement, il doit couler « tout seul ») sur les cercles dessinés de la carte de prélèvement.
• Le sang doit saturer le papier et complètement remplir le nombre de cercles requis par le laboratoire de référence.
• Alternativement, transférer 50 microlitres de sang total à l’aide d’une pipette, sur les cercles après un prélèvement veineux (sur un tube EDTA/violet).
  Remarque : utiliser impérativement des embouts de pipettes automatiques avec filtres si des tests de biologie moléculaire sont envisagés.
• Appliquer une compresse sur le site de ponction et exercer une pression jusqu’à l’arrêt du saignement.
• Retirer les gants non stériles et les jeter avec les autres déchets dans les containers  appropriés.
• Réaliser une procédure d’hygiène des mains.

Après le prélèvement

La carte de prélèvement imprégnée de sang doit sécher à l’air libre, à l’horizontal pendant 3 à 4 heures dans un endroit à l’abri de la lumière directe du soleil, de la poussière, d’insectes et des courants d’air. Ne pas laisser plusieurs papiers filtres se toucher, surtout lorsque l’échantillon n’est pas sec. Il existe des racks de séchage comme le portoir inclus dans le kit.

Une fois sèche, chaque carte de DBS est conservée dans un sachet de transport, imperméable aux gaz et transparent, avec des sachets de gel de silice pour absorber l’humidité et une carte indicatrice d’humidité. Les cartes DBS sont conservées, idéalement en chaine de froid  (+2 °C à +8 °C) ou à moins de 25 °C sans lumière ni humidité, dès que possible après séchage. Il est important de garantir que les cartes DBS sont tout à fait sèches avant d’être emballées.  


Les analyses qui doivent être réalisées peuvent être de mauvaise qualité dans le cas contraire. Le taux d’humidité des cartes DBS doit être vérifié tous les jours. Si ce taux atteint 30%, l’indicateur d’humidité et le gel de silice doivent être changés.

Pour les envois, les cartes DBS sont laissées dans leur sachet de transport avec un indicateur d’humidité mais avec des sachets de gel de silice neufs. Ces cartes DBS sont exemptées des règlementations IATA.

4.1.2 Prélèvement de sang veineux et préparation du sérum et plasma (n’est plus le standard)

Prélèvement de sang veineux

Matériel

• HYDRO-ALCOOLIQUE, solution, 500 mL, fl. [DEXTALCO5S-]
• CHLORHEXIDINE 2%, 70% d'alcool isopropylique, TAMPON/LINGETTE [DEXTCHLHA2W ],
  1er choix
• MARQUEUR, permanent, noir, pointe fine LABMARK1B-] (tube Ø 13/15 mm, 5 mL) PORTOIR [ELABTUBE12R]
• GARROT élastique, 100 x 1,8 cm [EMEQTOUR1--]
• PLATEAU A PANSEMENTS, 30 x 20 x 3 cm, inox [EMEQTRAD3--]
• SUCROSE, 24% solution orale, 2 mL, fl. [SDDCSUCR2V2], pour enfants < 6 mois
• COMPRESSE, NON TISSEE, 4 plis, 7,5 cm, non stérile [SDRECOMN7N-]
• COTON hydrophile, rouleau, 500 g [SDRECOTW5R-]
• SPARADRAP, rouleau, 2 cm [SDRETAPA025]
• CONTAINER D’OBJETS TRANCHANTS [SINSCONT+++]
• GANTS D’EXAMEN, latex, u.u. non stérile [SMSUGLOE1--]
• Pour sérum : (s.prél.sang.) TUBE SOUS VIDE, plastique, K2EDTA, 2 mL, mauve [STSSBSVT2E-]
• Pour plasma :
  • TUBE SOUS VIDE, plast., SEC, 2 mL, rouge [STSSBSVT2S-] 
    ou TUBE SOUS VIDE, plast., SEC, 4 mL, rouge [STSSBSVT4S-]
• CORPS PORTE TUBE avec éjecteur d’aiguille [STSSBSVVH1- ]
• AIGUILLE, stérile, 21G (Vacutainer®) [STSSBSVVN21]
• (UNITE PRELEVEMENT à ailettes, 23G (Vacutainer®) [STSSBSVVN23W]

Procédure de prélèvement

• Le patient doit être confortablement installé, avec le bras en déclive posé sur un support.
• Réaliser une procédure d’hygiène des mains.
• Étiqueter les tubes avec le numéro d’identification unique du patient, la date et l’heure du prélèvement.
• Repérage de la veine : cette étape n’est pas indispensable mais peut se révéler nécessaire si le patient présente un circuit veineux peu visible.
• Appliquer le garrot sur le membre choisi (4 doigts au-dessus du site de ponction pour les adultes et 2 doigts pour la néonatalogie et la pédiatrie).
• Choisir le site pour la ponction veineuse par palpation. Demander au patient de serrer/ desserrer le poing. Une fois la veine identifiée, retirer le garrot.
• Adapter le support pour tube de prélèvement (Vacutainer®) sur l’aiguille de prélèvement.
• Pour les nourrissons (moins de 6 mois) :
  • Envisager l’utilisation d’une solution buvable de sucrose 2-3 minutes avant la ponction et si la procédure dure plus de 5 minutes, une 2e dose peut être donnée.
  • Envisager d’immobiliser l’enfant à l’aide d’une serviette ou en demandant l’aide d’un assistant.
• Réaliser une procédure d’hygiène des mains et enfiler une paire de gants non-stériles.
• Désinfecter la peau du patient en effectuant un mouvement de va-et-vient pendant 30 secondes avec une compresse imbibée de solution antiseptique. Laisser sécher.
• Appliquer le garrot.
• Retirer le capuchon de l'aiguille et orienter le biseau de l’aiguille vers le haut. Maintenir la veine en appliquant une traction avec le pouce, en prenant soin de ne pas toucher le site d'insertion.
• Avec la main dominante, d’un geste franc, insérez l’aiguille dans la veine suivant un angle d’approximativement 15 à 30 °.
• Réduire l'angle d’insertion de l'aiguille dès que vous sentez la perforation de la paroi veineuse (ou qu’apparait un retour de sang dans la tubulure si vous utilisez une aiguille à ailettes), puis, si possible, enfoncer légèrement l'aiguille dans la veine.
• Commencer le prélèvement en enfonçant le premier tube de prélèvement dans le support jusqu’à perforer le bouchon du tube.
• Remplir, selon le vide/jusqu’à la marque indiquée, le nombre de tubes nécessaires en évitant tout mouvement de l’aiguille dans la veine lors du remplacement des tubes dans le support. Retirer les tubes lorsque le volume de sang nécessaire est atteint.
• Lorsque le dernier tube de sang est rempli, relâcher le garrot avant de désadapter ce dernier tube (s’il s’agit d’une petite veine et que le garrot a été maintenu en place).
• Placer le tampon de coton sec sur le point de ponction et retirer l’aiguille. Appliquer une pression suffisante sur le coton pour arrêter le saignement. Un sparadrap peut être posé sur le coton si le saignement persiste au-delà d’1 minute. L’infirmier peut aussi demander au patient de maintenir le pansement jusqu’à arrêt du saignement. Ne jamais plier le coude (cela augmente le risque d’hématome).
• Mettre immédiatement l’aiguille dans un container à aiguilles et éliminer correctement les autres déchets, conformément aux procédures habituelles.
• Retourner doucement les tubes 5 à 10 fois.
• Retirer les gants non stériles et les jeter avec les autres déchets dans les containers appropriés.
• Réaliser une procédure d’hygiène des mains.

Après le prélèvement

• Mettre les tubes dans le sachet ou la boite de transport.
• Conserver les tubes à l’abri de la lumière directe du soleil. Suivre la procédure habituelle pour le transport des échantillons vers le laboratoire.

Préparation du plasma ou de sérum

Matériel

• PINCE BRUCELLE, 14 cm, droite, inox [ELABFOBR1--], pour sortir les tubes de la centrifugeuse
• MARQUEUR, permanent, noir, pointe fine [ELABMARK1B-]
• PIPETTE DE TRANSFERT, graduée, plastique, stérile, u.u. [ELABPIPT1S-]
• CRYOTUBES, 2.0 mL, conique, filetage ext., stér. sans DNA/RNAse [ELABTUMC20EP]
• BOITE STOCKAGE, PP, 9x9 microtubes 1-2 mL, autoclavable [ELABTUMB81PP]
• PORTOIR, PK, 6x4 microtubes, autoclavable [ELABTUMR24PK]
• CENTRIFUGEUSE, manuelle + 4 tubes 15 mL [ELAECENE1M-], si centrifugeuse électrique non disponible
• CENTRIFUGEUSE électrique (Hetich EBA 200), 8 tubes, 230V [ELAECENE9--], pièces détachées et protection électrique

Pour le sérum :

• TUBE SOUS VIDE, plast., SEC, 2 mL, rouge [STSSBSVT2S-]
• TUBE SOUS VIDE, plast., SEC, 4 mL, rouge [STSSBSVT4S-]

Pour le plasma :

• TUBE SOUS VIDE, plastique, K2EDTA, 2 mL, mauve [STSSBSVT2E-]
• TUBE SOUS VIDE, plastique, K2EDTA, 4 mL, mauve [STSSBSVT5E-]
• TUBE SOUS VIDE, plast., HEPARINE Li 2 mL vert [STSSBSVT2HL]
• TUBE SOUS VIDE, plast., HEPARINE Li 4 mL vert [STSSBSVT5HL]

Procédure de préparation de sérum

• Après prélèvement de sang sur tube sec/rouge, ceux-ci doivent rester au moins 20 minutes sur la paillasse pour permettre la coagulation complète du sang avant la centrifugation.
• Les tubes doivent ensuite être centrifugés à 1000 g pendant 10 minutes. Cela correspond à environ 3200 tpm (tours par minute) avec la centrifugeuse Hetich EBA 200. Comme pour toutes centrifugeuses, il faut assurer la balance en plaçant des tubes de poids identiques à l’opposé l’un de l’autre. Les centrifugeuses manuelles possèdent 4 places pour les tubes. Il faut bien balancer la centrifugeuse pour ne pas abîmer le rotor. Les centrifugeuses manuelles atteignent une vitesse de 3000 tpm.
• En l’absence de laboratoire ou si aucune centrifugeuse n’est disponible, il faut laisser le tube pendant 1 heure à température ambiante puis, le placer en position verticale dans le frigo (+2 °C à +8 °C) jusqu’à rétractation complète du caillot (sérum jaune et translucide). L’échantillon peut rester maximum 24 heures au frigo avant de séparer le sérum (pour des tests ELISA).
• Identifier un cryotube avec le numéro d’identification unique du patient et la date de prélèvement.
• Transférer le sérum dans ce cryotube à l’aide d’une pipette.

Procédure de préparation de plasma

• Après prélèvement de sang sur un tube avec anticoagulant (tel que : EDTA/violet, héparine/vert), il est nécessaire de bien mélanger le sang avec l’anticoagulant en retournant le tube 5 à 10 fois, complètement et doucement.
• Ensuite, les tubes peuvent être centrifugés à 1000 g pendant 10 minutes (soit 3200 tpm avec la centrifugeuse Hetich EBA 200).
• Tout comme pour la préparation de sérum, il est possible d’utiliser une centrifugeuse manuelle.
• Identifier un cryotube avec le numéro d’identification unique du patient et la date de prélèvement.
• Transférer le plasma dans ce cryotube à l’aide d’une pipette.
  
  Remarques :
  Utiliser impérativement des pipettes stériles ou des embouts de pipettes automatiques avec filtres si des tests de biologie moléculaire sont envisagés.
   
• Il est important que l’échantillon ne soit pas hémolysé car cela entrainerait l’impossibilité de réaliser l’analyse. Pour cela, il faut éviter de transporter le tube de prélèvement avant de l’avoir centrifugé et d’avoir séparé le plasma. Si cela n’est pas possible, on peut réduire les risques d’hémolyse en plaçant les tubes dans des éponges durant le transport (réduction des chocs).

4.2 Conservation des échantillons

4.3 Transport, emballage, expédition

Sang sur papier filtre

Ces prélèvements ne sont pas considérés comme dangereux selon la réglementation IATA. Cependant pour un envoi de papier filtre par un transporteur :

• Avoir un triple emballage : sachet individuel + sachet Zip-lock + enveloppe (papier ou carton) de 10 cmx 10 cm minimum. L’indication « Echantillon d’origine humaine exempté /Exempt human specimen » doit apparaitre sur l’emballage extérieur et sur le bon de transport.

Sang total sérum, ou plasma

Protéger chaque tube dans un triple emballage spécifique répondant à la réglementation pour le transport de matières infectieuses de catégorie B, N° ONU 3373.

Avant l’envoi

Vérifier que :

• Les contenants sont hermétiquement fermés
• Les informations sont notées sur le registre du laboratoire
• Les fiches de renseignements patients sont placées dans l’emballage

Lors de l’envoi

• Inscrire l’adresse précise (y compris service, nom du destinataire)
• Si sang total ou sérum : compléter les informations sur l’emballage extérieur (3373)
• Joindre les documents nécessaires à l’expédition
• Enregistrer l’envoi pour permettre un suivi (réception au laboratoire, transmission 
  des résultats)
• Avertir les services concernés de l’envoi de ou des échantillons

4.4 Laboratoires de référence

Envoyer de préférence les prélèvements aux laboratoires nationaux, sinon, s’adresser au laboratoire du réseau OMS Lab Net le plus proche ou contacter les référents laboratoire.